Los virus mesófilos y termófilos están asociados con el ciclo de nutrientes durante el compostaje hipertermofílico

The ISME Journal volumen 17, páginas 916–930 (2023)Cite este artículo

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Si bien la descomposición de la materia orgánica por parte de las bacterias desempeña un papel importante en el ciclo de los nutrientes en los ecosistemas terrestres, la importancia de los virus sigue siendo poco conocida. Aquí combinamos metagenómica y metatranscriptómica con muestreo temporal para estudiar la importancia de las bacterias mesófilas y termófilas y sus virus en el ciclo de nutrientes durante el compostaje hipertermofílico (HTC) a escala industrial. Nuestros resultados muestran que la dinámica y la actividad de la densidad virus-bacteria están estrechamente acopladas, donde los virus específicos de las bacterias mesófilas y termófilas rastrean las densidades de sus huéspedes, lo que desencadena la sucesión de la comunidad microbiana a través del control de arriba hacia abajo durante el HTC. Además, los virus específicos de las bacterias mesófilas codificaron y expresaron varios genes metabólicos auxiliares (AMG) vinculados al ciclo del carbono, lo que afecta la renovación de nutrientes junto con las bacterias. El recambio de nutrientes se correlacionó positivamente con la proporción virus-huésped, lo que indica una relación positiva entre el funcionamiento del ecosistema, la abundancia viral y la actividad viral. Estos efectos fueron impulsados ​​predominantemente por virus de ADN, ya que la mayoría de los virus de ARN detectados estaban asociados con eucariotas y no con el ciclo de nutrientes durante la fase termófila del compostaje. Nuestros hallazgos sugieren que los virus de ADN podrían impulsar el ciclo de nutrientes durante el HTC al reciclar la biomasa bacteriana a través de la lisis celular y al expresar AMG clave. Por tanto, los virus podrían utilizarse como indicadores del funcionamiento de los ecosistemas microbianos para optimizar la productividad de los sistemas biotecnológicos y agrícolas.

La descomposición de la materia orgánica es un proceso ecosistémico clave que afecta el ciclo de nutrientes y la productividad en los ecosistemas terrestres [1]. Si bien se sabe que tanto las comunidades bacterianas como fúngicas desempeñan funciones cruciales en el reciclaje de nutrientes a través del "bucle microbiano" [1], el papel de los virus bacterianos, es decir, los bacteriófagos (fagos), aún no se comprende bien [2]. Como entidad biológica más abundante en la Tierra, los virus desempeñan un papel fundamental en impulsar la mortalidad microbiana a través de la lisis celular [3, 4], impactando significativamente el ciclo de elementos a través de la liberación de nutrientes y afectando la composición, la diversidad y la necromasa microbiana de la comunidad microbiana [5,6, 7,8,9,10]. Si bien la importancia de los virus para el ciclo de nutrientes en los océanos está bien establecida [11], apenas estamos comenzando a comprender cómo los virus modulan la renovación de nutrientes y la mineralización de la materia orgánica en los suelos [9, 10, 12]. Se ha demostrado que los genes metabólicos auxiliares (AMG) codificados por virus asociados con las glucósidos hidrolasas y el metabolismo del metano contribuyen al ciclo del carbono en los ecosistemas del suelo [4, 6, 13]. Por ejemplo, 14 AMG, incluidas 9 familias de glucósidos hidrolasas, como la endomananasa con actividad funcional confirmada, indican que los virus tienen la capacidad potencial de participar en la degradación compleja del carbono [4]. Además de impulsar el ciclo de nutrientes mediante la lisis de células bacterianas en los suelos, recientemente se ha demostrado que los virus mejoran la supervivencia de sus bacterias hospedadoras bajo estrés ambiental al codificar genes metabólicos auxiliares (AMG) que mejoran la capacidad metabólica de las bacterias hospedadoras [14]. A pesar de estos avances recientes, todavía tenemos una comprensión limitada sobre cómo los virus y las bacterias juntos impulsan el ciclo de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica en los ecosistemas terrestres [15].

Aquí utilizamos un compostaje hipertermofílico (HTC) como sistema modelo para estudiar el papel de las bacterias mesófilas y termófilas y sus virus en la descomposición de la materia orgánica. HTC es una tecnología de tratamiento de residuos utilizada en la degradación de la fracción orgánica de residuos sólidos municipales o agrícolas, alcanzando temperaturas extremadamente altas (hasta 90 °C) sin calentamiento exógeno debido a la actividad de la comunidad bacteriana termófila [16,17,18]. HTC contiene tres fases de temperatura principales: hipertermófila (>80 °C), termófila (>50 °C) y fase de maduración (temperatura ambiente). Durante el proceso, las sustancias poliméricas enriquecidas con carbono y nitrógeno (lignocelulosa, proteínas, polisacáridos y lípidos) se degradan durante las fases termófilas del compostaje, mientras que los compuestos enriquecidos en húmicos que se degradan lentamente se degradan durante la fase de maduración. La composición de las comunidades microbianas que impulsan la degradación de la materia orgánica cambia dinámicamente después de la temperatura de compostaje durante el HTC [19], y los taxones termófilos y resistentes al calor (Firmicutes; Bacillus y Deinococcota; Thermus) son importantes para la descomposición de la materia orgánica durante el proceso. fase termófila [16]. Si bien los efectos de la temperatura, las materias primas y las propiedades fisicoquímicas del compostaje se han estudiado ampliamente en relación con el ensamblaje de comunidades microbianas y la degradación de la materia orgánica [20, 21], se sabe muy poco sobre el papel de los virus durante el HTC.

Los virus podrían mediar los efectos sobre las bacterias durante el HTC de dos maneras principales. En primer lugar, podrían imponer un fuerte control de arriba hacia abajo sobre la abundancia de bacterias mediante lisis, como se ha demostrado en los sistemas acuáticos [22]. Tal depredación viral podría moldear el ciclo de nutrientes de la biomasa bacteriana [8, 9], impulsar la sucesión ecológica de taxones mesófilos y termófilos durante el HTC y potencialmente promover la diversidad bacteriana con el tiempo al reducir los efectos de dominancia a través del modelo "Matar al ganador" [23 , 24]. En segundo lugar, los virus podrían impulsar el ciclo de nutrientes mediante la provisión de genes funcionales asociados con la descomposición. Por ejemplo, se ha demostrado que los AMG virales pueden ayudar potencialmente a las bacterias huésped a adquirir nutrientes y degradar compuestos tóxicos, lo que tiene un efecto positivo en su supervivencia [14]. Dado que los virus requieren maquinaria de la célula huésped para la transcripción de sus genes, la actividad viral basada en la transcriptómica puede usarse para indicar una infección exitosa de los huéspedes [25]. Este enfoque se ha utilizado recientemente para demostrar que los sedimentos del fondo marino muestran actividad tanto por virus líticos como lisogénicos [26], y que la expresión de AMG posiblemente esté involucrada en la modulación del metabolismo del metano y el azufre del huésped tras la infección en el ecosistema oceánico [22, 27]. y que los virus gigantes están activos en el sistema marino costero [28]. Aquí, elegimos HTC rico en microbios como sistema modelo para evaluar la composición, diversidad y actividad de la comunidad bacteriana y viral en relación con el recambio de carbono y nitrógeno [16]. Además, como HTC se caracteriza típicamente por una sucesión de comunidades microbianas dependiente del tiempo, comparamos específicamente el papel de las bacterias mesófilas y termófilas y sus virus de ADN en la dinámica del ciclo de nutrientes.

En este estudio, utilizamos un experimento de compostaje hipertermofílico a escala industrial para crear un muestreo temporal replicado del ensamblaje de la comunidad bacteriana-viral, su abundancia, contenido de genes funcionales y actividad basada en metagenómica y metatranscriptómica. Descubrimos que la dinámica y la actividad de la densidad de virus y bacterias están acopladas, donde los virus específicos de las bacterias mesófilas y termófilas rastrean las densidades de sus huéspedes, lo que indica un fuerte control viral de arriba hacia abajo durante el HTC. Estos efectos fueron impulsados ​​predominantemente por virus de ADN, ya que la mayoría de los virus de ARN detectados (82%) estaban asociados con eucariotas y desacoplados del ciclo de nutrientes durante la fase termófila del compostaje. Además, los virus de ADN específicos de bacterias mesófilas codificaron y expresaron varios AMG vinculados al ciclo del carbono, lo que impactó la renovación de nutrientes junto con las bacterias. Como resultado, la abundancia y actividad viral se correlacionaron positivamente con el ciclo de nutrientes, destacando la importancia de los virus para la degradación de la materia orgánica durante el HTC.

El experimento de compostaje se llevó a cabo en una planta de compostaje hipertermófila a gran escala ubicada en el distrito de Shunyi, Beijing, China (40°03′10.48″N, 116°56′2.12″E). Se utilizaron lodos de depuradora y cáscara de arroz como principales materias primas de compostaje, como se describe en un estudio anterior [16]. El compostaje hipertermófilo normalmente tarda 45 días desde el inicio hasta el final e incluye cuatro fases de temperatura: fase inicial (día 1: 32 °C), fase hipertermófila (del día 2 al 9: >90 °C), fase termófila (del día 10 al 26 : >55 °C) y fase de maduración (del día 27 al 45: <45 °C). Para cubrir los cambios durante todo el proceso de compostaje, se recolectaron ocho muestras de cinco pilas de compost en diferentes fases del compostaje hipertermofílico en los días 0 (D0), 4 (D4), 7 (D7), 9 (D9), 15 (D15). 21 (D21), 27 (D27), 33 (D33) y 45 (D45). Para obtener muestras bien distribuidas y homogeneizadas, cada pila se dividió diagonalmente en cinco dominios, y cada dominio se tomó como muestra desde el mismo lugar a una profundidad de 40 a 50 cm en diferentes momentos de muestreo. Dentro de cada pila, se recolectaron cinco submuestras (5000 g cada una) por dominio y luego se mezclaron en una única muestra compuesta, que se dividió en dos alícuotas. Una alícuota replicada se almacenó en nitrógeno líquido para análisis biológicos y la otra se mantuvo a 4 °C para análisis fisicoquímicos. Se utilizó un controlador de temperatura automático para determinar los cambios de temperatura durante el compostaje.

Los cambios en las propiedades fisicoquímicas del compost se midieron utilizando los métodos descritos anteriormente [16], a menos que se especifique lo contrario. El ciclo del carbono se evaluó en función del contenido de carbono total (TC), el carbono soluble en agua (WSC), el contenido de carbono orgánico total (TOC) y el contenido de carbono inorgánico (IC). El ciclo del nitrógeno se cuantificó en función de las concentraciones de contenido total de nitrógeno (TN), nitrógeno soluble en agua (WSN), amonio (NH4+) y nitrato (NO3-). El TOC y el IC se cuantificaron utilizando un analizador automático de TOC para muestras líquidas (Shimadzu TOC-L CPH, Kyoto, Japón), mientras que el TN y el TC se determinaron con un instrumento Elementar (Vario MAX cube, Hanau, Alemania) mediante combustión seca. El contenido de materia orgánica (MO) se midió mediante combustión seca a 550 °C durante 8 h. Los valores de TN y TC se utilizaron para calcular la relación C/N. Otras propiedades fisicoquímicas medidas incluyeron pH, contenido de agua (WC) y conductividad eléctrica (CE). La concentración de WSN se basó en la suma de los contenidos de NH4+ y NO3-, mientras que la concentración de WSC se basó en la suma de TOC e IC.

Para determinar los cambios en la composición y diversidad de la comunidad bacteriana durante el compostaje, todas las muestras recolectadas (cada punto de tiempo consta de 5 réplicas) se sometieron a secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA utilizando una plataforma NovaSeq6000 (Illumina, modo PE250, Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd, Guangzhou, Porcelana). El ADN genómico total para la secuenciación de amplicones se extrajo utilizando un kit DNeasy PowerSoil (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los cebadores procariotas (bacterias y arqueas) 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') y 907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') dirigidos a la región V4-V5 del gen 16S rRNA. Las secuencias del gen 16S rRNA sin procesar se procesaron usando QIIME 2 (versión 2019.7) [29] y se filtraron por calidad (es decir, se filtraron, se eliminaron las replicaciones, se eliminaron los ruidos, se fusionaron y se evaluaron para detectar quimeras) para producir variantes de secuencia de amplicones (ASV) utilizando la tubería DADA2 en QIIME2 [30]. Los parámetros de truncamiento y recorte en DADA2 se establecieron en –p-trim-left-f 0, –p-trim-left-r 0; y –p-trunc-len -f 248, –p-trunc-len-r 230. La tabla de características generada por DADA2 se filtró para eliminar los ASV con una frecuencia inferior a dos y los ASV restantes se clasificaron utilizando el clasificador ingenuo de Bayes QIIME2. capacitados en el 99% de unidades taxonómicas operativas disponibles en la base de datos SILVA rRNA (v 138) [31]. La diversidad microbiana se estimó utilizando la diversidad alfa (índice de Shannon y OTU observada) y la composición de la comunidad utilizando la diversidad beta (distancia UniFrac ponderada) basada en la tubería de diversidad q2 dentro de QIIME2. Para cuantificar el proceso de asamblea comunitaria, se utilizó un análisis de modelo nulo para detectar el mecanismo de asamblea comunitaria calculando la desviación estándar entre el modelo ecológico observado y el modelo ecológico generado aleatoriamente [32, 33].

Se seleccionaron tres muestras replicadas de compost seleccionadas al azar para la secuenciación escopeta de ADN y ARN en los días 0, 4, 15 y 27 de compostaje, que representaron las fases de calentamiento, hipertermófila, termófila y de maduración del compostaje, respectivamente (dando como resultado un total de 12 metatranscriptomas). y 12 muestras de metagenoma). Un subconjunto de cada muestra replicada se usó para la extracción de ADN para mejorar la recuperación de genomas ensamblados en metagenoma (MAG), mientras que el otro se usó para la extracción total de ARN para examinar la expresión génica a nivel comunitario mediante metatranscriptómica. Antes de la extracción de ARN, las muestras se almacenaron inmediatamente en RNAlater (ThermoFisher Scientific) y nitrógeno líquido. El ADN y el ARN genómico total se extrajeron de muestras de compost de 0,5 g utilizando el kit DNeasy PowerSoil (Qiagen, Hilden, Alemania) y el kit de ARN total RNeasy PowerSoil (Qiagen), respectivamente, siguiendo los protocolos de los fabricantes. Las muestras no se filtraron antes del procesamiento metagenómico y, por lo tanto, contenían virus de vida libre y profagos intactos. La calidad del ADN se evaluó con un gel de agarosa al 1% y la concentración de ADN se midió utilizando ensayos de alta sensibilidad Qubit dsDNA (Thermo Fisher, Waltham, EE. UU.). Las concentraciones de ARN se midieron utilizando el kit de ensayo Qubit RNA HS y la integridad del ARN se determinó utilizando un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) antes y después de la eliminación del ARNr con el kit de aislamiento de transcriptoma Ribo-minus (Thermo Fisher, Waltham, EE. UU.). El ARNm enriquecido resultante se preparó para la secuenciación utilizando el kit de preparación de biblioteca de ARNm de cadena TruSeq (Illumina, California, EE. UU.), siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN y el ADNc extraídos de cada muestra se utilizaron para construir bibliotecas (300 pb) en Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de preparación de biblioteca de ADN V2 para Illumina (Illumina, California, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante, que es compatible. con todo el ADN, incluido el dsDNA. Si bien este kit elimina la mayoría de los virus ssDNA, una pequeña fracción de los virus ssDNA incorporados en genomas bacterianos como dsDNA o intermediarios de dsDNA de la replicación activa probablemente permanecieron en nuestras bibliotecas [34]. La secuenciación se realizó mediante la plataforma NovaSeq6000 (Illumina, modo PE150, Guangdong Magigene Biotechnology Co. Ltd). La información detallada sobre los conjuntos de datos de secuenciación de ADN y ARN se resume en la Tabla S7.

Todas las secuencias de ADN se recortaron para eliminar los adaptadores de Illumina y conservar lecturas de alta calidad utilizando Trimmomatic (v 0,39, puntuación >30 y longitud >36 bases) [35]. Todas las secuencias de alta calidad se ensamblaron utilizando SPAdes v3.13.1 con los parámetros "-k 33, 55, 77, 99, 111,127 --meta" [36]. También reunimos lecturas generadas en cada fase térmica del compostaje por separado (ensamblajes específicos de la fase de compostaje) utilizando SPAdes con los mismos parámetros. Todos los andamios ensamblados de más de 2,0 kb se agruparon utilizando metawrap [37] basado en MetaBAT2 [38], MaxBin2 [39] y Concoct [40] con parámetros predeterminados. Los contenedores se seleccionaron manualmente para obtener genomas de alta calidad utilizando el módulo Bin_refinement en Metawrap [37]. La integridad y la contaminación de los contenedores de genoma se evaluaron utilizando CheckM v1.0.13 [41], y los genomas ensamblados en metagenoma (MAG) con más del 50 % de integridad y menos del 10 % de nivel de contaminación se retuvieron para análisis adicionales. Se eliminaron las replicaciones de contenedores de diferentes muestras para producir genomas de calidad media a alta utilizando dRep v.2.3.2 [42] y se asignaron a clasificaciones taxonómicas basadas en la Base de datos de taxonomía del genoma (GTDB; versión 03-RS86) utilizando el kit de herramientas GTDB-Tk (v .0.3.2) con el flujo de trabajo de clasificación [43]. Para construir MAG bacterianos, los genes se llamaron usando Prodigal con parámetros "-p meta" [44] y se anotaron en las bases de datos KEGG y Pfam usando la herramienta Diamond [45]. Las proteínas predichas se examinaron en busca de CAZymes candidatas utilizando el módulo hmmscan de HMMER v3.2.1 y la base de datos dbCAN (límites: fracción de cobertura: 0,40; valor e: 1e-18) [46]. Los genes que codifican proteasas y peptidasas se identificaron utilizando Diamond frente a la versión 12.0 de la base de datos MEROPS (límites: valor e 1e-20 -accel 0,8). Los ARN ribosómicos se predijeron utilizando RNAmmer v1.2 [47]. La temperatura óptima de crecimiento (OGT) de los MAG se predijo mediante el método de aprendizaje automático utilizando el Tome v1.1 [48]. Los MAG termófilos se definieron como aquellos con OGT ≥ 50 °C, mientras que los MAG se asignaron como mesófilos cuando su OGT <50 °C. Para construir árboles MAG filogenéticos, se utilizó el flujo de trabajo de "clasificación" en GTDB-Tk (v.0.3.2; configuración predeterminada) para identificar 120 genes marcadores bacterianos, que se utilizaron para la construcción de árboles basándose en una alineación de secuencias múltiples. Los archivos FASTA resultantes que contienen múltiples alineamientos de secuencias de los genomas enviados se utilizaron para la inferencia de árboles filogenéticos de máxima probabilidad utilizando FastTree v.2.1.10 con los parámetros predeterminados [49]. Los archivos de salida del árbol Newick se visualizaron con iTOL v.5 [50].

Para identificar virus con alta confianza, se recuperaron contigs virales de más de 5 kb de conjuntos de metagenomas y se analizaron utilizando una combinación de tres herramientas con umbrales de calidad estrictos, como se sugirió anteriormente [51]. En primer lugar, DeepVirFinder v1.0 [52] se ejecutó con un límite flexible (puntuación 0,7 y p < 0,05) para obtener la máxima sensibilidad para detectar secuencias virales. En segundo lugar, se utilizó VirSorter2 v2.2.1 [53] para identificar las supuestas secuencias virales con puntuaciones ≥0,95 utilizando secuencias de salida de DeepVirFinder como archivos de entrada. Para eliminar algunas secuencias no virales durante el análisis de VirSorter2, se utilizó CheckV (v0.9.0)[54] para la evaluación de calidad. El conjunto de datos de contig viral final se curó y recortó manualmente para eliminar posibles regiones hospedadoras de acuerdo con el protocolo anterior [55]. Los contigs previstos se consideraron de origen viral si cumplían con al menos uno de los tres criterios siguientes: (1) los contigs contenían al menos un gen distintivo específico del virus; (2) los contigs tenían puntuaciones VirSorter2 ≥0,95; (3) el número total de genes anotados como "desconocidos" (base de datos egg-NOG v5.0.0) representó ≥80% del número total de genes en el andamio. Finalmente, todos los posibles contigs virales se verificaron utilizando VIBRANT [56] (v1.2.1, modo virome) con la configuración predeterminada. Los contigs virales identificados se agruparon con una identidad de nucleótidos promedio del 95 % con al menos un 85 % de cobertura utilizando CD-HIT v4.8.1 [57] (parámetros: -c 0,95 -aS 0,85), lo que resultó en un total de 1297 OTU virales (de aquí en adelante denominadas “vOTU”). La secuencia más larga de cada grupo se utilizó como secuencia representativa de un grupo viral determinado en análisis posteriores. La integridad de los genomas virales se estimó utilizando el sistema CheckV. Para determinar la superposición entre nuestras vOTU representativas y los virus incluidos en el conjunto de datos IMG/VR v3 [58], utilizamos una agrupación rápida de genomas para identificar las vOTU de nuestro conjunto de datos que compartían un 95 % de identidad y un 85 % de cobertura con virus basados ​​en IMG/VR v3. en los scripts (script aniclust.py) proporcionados en CheckV con los parámetros “--min_ani 95 --min_qcov 0 --min_tcov 85”.

La asignación taxonómica de contigs virales se realizó utilizando PhaGCN2 según las últimas tablas de clasificación de ICTV [59]. Los virus de referencia se obtuvieron de la base de datos viral RefSeq (v216, publicada en enero de 2023). En el caso de virus no clasificados, se utilizó CAT [60] para asignar taxonomías virales utilizando el algoritmo Lowest Common Ancestor contra la base de datos NCBI nr. Solo unas pocas vOTU de compost (7,7%) se agruparon con virus taxonómicamente conocidos según los dos métodos anteriores. Las proteínas funcionales no redundantes en los contigs virales se anotaron (Tabla S8) utilizando VIBRANT basado en las bases de datos Pfam, dbCAN, KEGG y eggNOG 5.0 con parámetros predeterminados [4, 61]. El estilo de vida de los fagos se predijo utilizando tres herramientas que incluyen VIBRANT [56], PhaTYP [62] y BLAST curado manualmente [25] basándose en métodos descritos previamente [25, 63]. Brevemente, se utilizaron VIBRANT [56] y BLAST manual [25] para inferir el estilo de vida templado mediante la identificación de contigs virales que contenían proteínas asociadas con la lisogenia (transposasa, integrasa, escisionasa, resolvasa y recombinasa) [74]. Debido a que varios contigs virales están incompletos, también se utilizó un método de aprendizaje automático llamado PhaTYP [62] para predecir el estilo de vida de los fagos. Se infirió que el virus era un fago templado si cualquiera de estas herramientas predecía que sería lisogénico. Además, las vOTU agrupadas con fagos templados conocidos durante la agrupación de vConTACT2 o que representan secuencias provirales se asignaron como templadas [25]. Todas las demás vOTU fueron asignadas como líticas, aunque la ausencia de proteínas templadas asociadas a fagos también podría haberse debido a que los genomas virales están incompletos.

Las abundancias relativas de vOTU y MAG en los 12 conjuntos de datos de metagenoma (cuatro puntos de tiempo de muestreo con tres réplicas cada uno) se cuantificaron utilizando el proceso CoverM [4] (v0.61, https://github.com/wwood/CoverM). Las abundancias relativas de vOTU y MAG se calcularon en función de la cobertura de lecturas mapeadas utilizando el modo "contig" y "genoma" para vOTU y MAG, respectivamente. Para calcular la abundancia relativa de cada vOTU y MAG, se asignaron lecturas con control de calidad de cada 12 metagenomas de compost al conjunto de 1297 genomas virales desreplicados o 228 MAG desreplicados con el canal CoverM utilizando el método de cálculo "rpkm" (lecturas por kilobase de exón por millones de lecturas asignadas). Se recomienda RPKM [63] para comparaciones de abundancia relativa con conjuntos de datos metagenómicos, porque RPKM normaliza los datos en función tanto de la profundidad de la secuencia (por millón de lecturas) como de la longitud de la secuencia (en kilobases). Para los virus, las lecturas después del control de calidad se asignaron primero a contigs virales usando el comando "make" en CoverM v0.6.1, para crear archivos BAM, después de que se usó el comando "filter" para eliminar alineaciones de baja calidad con identidad de lectura ≤95% y alineadas. porcentaje ≤75% (parámetros: --percentage_id 0,95 --percentage_aln 0,75). Los archivos bam filtrados se utilizaron como entrada en CoverM para generar perfiles de cobertura entre muestras (parámetros: --trim-min 0,10 --trim-max 0,90 --min-read-percent-identity 0,95 --min-read-aligned-percent 0,75 -m significa). Para los MAG, se utilizó el mismo protocolo de cálculo que para los vOTU, excepto que se utilizó el comando "genoma" en lugar de "contig" en el último paso. La cobertura de cada vOTU y MAG se fusionó como las matrices de abundancia bacteriana y viral, que se usaron directamente para los análisis de abundancia y diversidad alfa y beta (se usaron matrices transformadas logarítmicamente para las correlaciones de Mantel).

Las 1.297 vOTU se vincularon supuestamente a 228 MAG de huéspedes bacterianos utilizando tres métodos in silico [4, 64] donde los enlaces virus-hospedador se predijeron en función de: (1) contenido genómico compartido entre estructuras de huéspedes virales y bacterianos (puntuación de bits ≥ 50, e- valor <10−3, identidad ≥ 70% y longitud coincidente ≥ 2500 pb [4, 65]); (2) similitud de secuencia entre los espaciadores CRISPR entre estructuras bacterianas y virales; (3) coincidencia de secuencias de ARNt derivadas de vOTU en MAG con tRNAscan (v 2.0.9, utilizando los modelos general y bacteriano/arqueal, respectivamente) y BLAST (95 % de cobertura y 90 % de identidad de secuencia, valor e <1e-05 ) después de eliminar autoaciertos y duplicados [65]. Los espaciadores CRISPR se recuperaron de contigs metagenómicos de MAG bacterianos con CRT (v 1.2) con parámetros predeterminados [66]. Las secuencias espaciadoras extraídas se emparejaron con vOTU utilizando BLASTn (100% de identidad de nucleótidos, falta de coincidencia ≤1 y valor e ≤ 10-5). Como los valores de OGT de los virus no se pudieron determinar utilizando el Tomo v1.1 [48], los virus se determinaron como termófilos si estaban asociados con al menos un contenedor con OGT ≥ 50 °C.

La identificación sólida de posibles genes metabólicos auxiliares virales (AMG) a partir de metagenomas sigue siendo un desafío para el campo [22, 51]. Se requiere que una AMG potencial creíble tenga dos características siguientes [51, 63]: 1) las AMG potenciales deben ubicarse entre genes virales, donde tanto la región inicial como la final tienen genes distintivos virales o similares a los virales; 2) el candidato AMG debe participar en una vía metabólica celular. Con base en los principios anteriores, utilizamos herramientas de anotación automatizadas DRAM-v (v 1.2.0, parámetros predeterminados) para identificar AMG candidatos combinados con curación manual [67]. El archivo de anotaciones AMG de DRAM-v se perfeccionó aún más utilizando los siguientes parámetros: puntuación AMG de 1 a 3 y bandera AMG de -M y -F [67]. La anotación funcional de los AMG se realizó utilizando tres bases de datos: la base de datos de ortología genética de eggNOG 5.0 [68], la base de datos de enzimas activas sobre carbohidratos (CAZy) [46] (dbCAN2 HMMdb versión 10.0) y la base de datos KEGG [69]. También realizamos una curación manual para mejorar la confianza en la identificación de AMG como se describió anteriormente [51, 63, 70, 71] eliminando todos los AMG ilegítimos potenciales que fueron asignados a categorías de genes de reacciones relacionadas con el ADN, metabolismo de nucleótidos, invasión viral (es decir, lisozimas/endolisinas), modificación de componentes virales (es decir, glicosiltransferasas, adenililtransferasas y metiltransferasas que supuestamente participan en la modificación del ADN, ARN y proteínas estructurales virales). Esta cartera dio como resultado 194 AMG candidatos de alta confianza de 1297 vOTU. Para estudiar más a fondo el metabolismo del carbono mediado por AMG, se modelaron estructuralmente secuencias de proteínas de las glucósidos hidrolasas (GH) retenidas utilizando Phyre2 en modo de envío de lotes experto (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/ page.cgi?id=index) para confirmar y resolver sus predicciones funcionales [72]. De estos GH, en análisis posteriores se consideraron aquellos con estructura secundaria prevista con una puntuación de confianza del 100%.

Las lecturas metatranscriptómicas se filtraron por calidad a través de Trimmomatic (v 0.39) como se describió anteriormente [4]. Además, se utilizó SortMeRNA (v4.3.4) [73] para eliminar secuencias de ARN no codificantes (secuencias de ARNt, ARNtm, 5S, 16S, 18S, 23S y 28S) de las lecturas metatranscriptómicas. Las lecturas de ARNm totales restantes en 12 metatranscriptomas de compost (cuatro puntos de tiempo de muestreo con tres repeticiones cada uno) se asignaron a 228 contigs MAG o 1297 vOTU para identificar taxones bacterianos y virales activos en función de la cobertura promedio de transcripciones por genoma usando minimap2 [74] del oleoducto CoverM (https://github.com/wwood/CoverM). Brevemente, se utilizaron conjuntos de datos metatranscriptómicos como lecturas de entrada, utilizando los mismos parámetros de mapeo que con el mapeo de lectura metagenómica, excepto por elegir el método de cálculo "tpm" (Transcripciones por kilobase por millón de lecturas mapeadas, TPM). Toda la actividad se cuantificó a nivel de vOTU y MAG, y los virus y bacterias se consideraron activos cuando los valores de TPM eran mayores que 0 para ambos duplicados de dos de tres réplicas biológicas (los valores de TPM para cada MAG y vOTU se proporcionan en la Tabla complementaria 4). Como los virus contenían solo un contig (un vOTU), se consideraron activos incluso si un gen viral mostraba valores de TPM mayores que 0. Para determinar la expresión de genes anotados en MAG y vOTU ensamblados, las lecturas de ARNm se asignaron a un archivo Fasta concatenado. incluidos todos los genes de MAG bin o vOTU que utilizan Hisat2 con parámetros predeterminados [75]. La cuantificación de lecturas mapeadas por gen identificado se realizó con la función featureCounts del paquete R Subread [76]. La abundancia de transcripción de cada gen o contig se convirtió en transcripción por millón (TPM, ecuación (1)) para cada profundidad muestreada.

donde A = lecturas asignadas al gen/longitud del gen (kbp).

Como estudios recientes han sugerido que los virus de ARN también podrían ser actores importantes pero pasados ​​por alto que subyacen al funcionamiento del ecosistema [77,78,79,80], estudiamos los cambios en su diversidad y composición durante el compostaje siguiendo métodos informados en estudios anteriores [78, 79, 81]. Brevemente, utilizamos el gen distintivo de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) como gen objetivo para estudiar los virus de ARN durante el compostaje (un total de 12 muestras de metatranscriptoma, incluidos cuatro puntos de tiempo y tres réplicas). Todos los contigs ensamblados (>1000 pb, ensamblajes específicos de la fase de compostaje) se compararon con la base de datos que contiene todas las secuencias del gen RdRp viral disponible en NCBI/GenBank (37, 441 genes, descargados en febrero de 2023) y estudios publicados previamente [77, 78]. utilizando Diamond BLASTx (cobertura ≥ 70%, valor E ≤1e-10 y puntuación ≥ 70). Las secuencias que tuvieron coincidencias en la base de datos RdRp con el dominio central RdRp se consideraron posibles virus de ARN [80]. Este análisis identificó 109 contigs con el gen RdRp. Estos posibles cóntigos de virus de ARN se agruparon con CD-HIT utilizando una identidad de nucleótidos promedio del 95 % en una fracción de alineación del 85 %, lo que resultó en un total de 83 virus de ARN potenciales.

También analizamos la presencia de fagos de ADNss en cóntiges metatranscriptómicos ensamblados utilizando los mismos métodos que con otros virus (excepto la herramienta VIBRANT). Se obtuvieron un total de 68 supuestos contigs de fagos de ADNbc (con tamaños> 5 kb) de los ensamblajes metatranscriptómicos. Después de la agrupación (95% de similitud de nucleótidos y más del 85% de cobertura), se retuvieron un total de 41 unidades taxonómicas operativas virales de ADNbc (dsvOTU). Al comparar los contigs de los virus derivados de datos transcriptómicos y datos metagenómicos, solo se pudieron ensamblar 7 de 68 dsvOTU a partir de los datos metagenómicos. Esto no es sorprendente ya que el ADN se eliminó durante la preparación de la biblioteca de ARN y se retuvieron muy pocas secuencias de ADN en el transcriptoma.

Los datos se analizaron estadísticamente utilizando la plataforma R v 3.6.1 (https://www.r-project.org/) [82]. Los análisis de diversidad microbiana alfa y beta (incluido el índice alfa y PCoA) se realizaron utilizando paquetes vegan y ggplot2 en R. Las diferencias medias generales a lo largo del tiempo de muestreo se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de comparaciones múltiples utilizando la prueba Tukey HSD usando el p -valor menor que 0,05 como umbral de significancia. Se utilizó PERMANOVA no paramétrico (función de Adonis) para determinar la importancia de los puntos de tiempo de muestreo en la composición del microbioma. En el caso de las pruebas no paramétricas de rango con signo de Wilcoxon y de Adonis, la significación estadística se determinó basándose en 999 permutaciones. La expresión genética diferencial entre metatranscriptomas se analizó utilizando DESeq2 con corrección FDR en p = 0,05.

Para evaluar la diversidad de cada muestra, se evaluó la diversidad alfa (riqueza, índice de Shannon) utilizando el paquete “vegan” (https://cran.r-project.org/web/packages/vegan). La diversidad beta se cuantificó utilizando los dos primeros ejes de la matriz de disimilitud de Bray-Curtis. La significancia estadística entre los grupos de muestra se probó utilizando un PERMANOVA con 999 permutaciones.

Se realizó una prueba de Mantel parcial para evaluar la correlación entre dos matrices multivariadas mientras se controlaban los efectos potenciales del recambio de nutrientes (carbono y nitrógeno) utilizando el paquete R "vegano". Las distancias para las abundancias de vOTU y MAG y la renovación de nutrientes durante el compostaje se calcularon utilizando las matrices de disimilitud de Bray-Curtis. Se calcularon correlaciones parciales de Mantel entre todos los pares de matrices de distancia para MAG y vOTU con 999 permutaciones para cada comparación. La tasa de descubrimiento falso se calculó utilizando el método de Benjamini-Hochberg.

Para identificar los principales predictores que explican el ciclo de nutrientes durante el compostaje, comparamos la contribución de la composición de la comunidad bacteriana y viral (basada en las diferencias de Bray-Curtis) a nivel de ADN y ARN utilizando parámetros predeterminados del análisis Random Forest (RF) [83] . En estos modelos de RF, se determinó la importancia de cada predictor microbiano (composición de la comunidad bacteriana y viral a nivel de ADN y ARN) para la renovación de nutrientes del compost (diferencia de distancia euclidiana basada en todas las propiedades fisicoquímicas del compostaje). Para evaluar la importancia relativa de diferentes variables predictivas, comparamos los aumentos porcentuales en MSE (error cuadrático medio), donde los valores porcentuales altos de MSE denotan una contribución relativamente más importante de determinadas variables predictoras [84]. La importancia de los modelos y los valores de R2 con validación cruzada se evaluaron con 1000 permutaciones de la variable de respuesta utilizando el paquete "A3" en R. El análisis se realizó utilizando el paquete "rfPermute" en R.

Se empleó el modelo de ruta de mínimos cuadrados parciales (PLS-PM) para explorar los efectos directos e indirectos de diferentes tipos bacterianos (disimilaridad de Bray-Curtis de MAG mesófilos (OGT <50 °C) y termófilos (OGT ≥ 50 °C) y mesófilos y composición de la comunidad viral termófila (disimilaridad de Bray-Curtis de vOTU) y actividad catabólica (metatranscriptómica de MAG y vOTU) en relación con el ciclo del carbono y el nitrógeno durante el compostaje [85]. El índice de ciclo del carbono se determinó como un cambio temporal en la matriz de disimilitud (basado en Distancia euclidiana) para TC, OM, IC, WSC y TOC, mientras que el índice de ciclo del nitrógeno se basó en el cambio temporal en la matriz de disimilitud (basado en la distancia euclidiana) para TN, C/N, WSN, NH4+ y NO3-. El modelo PLS-PM se eligió en función de la estadística de bondad de ajuste (GoF), una medida del poder predictivo general del modelo. PLS-PM se analizó utilizando R v3.6.1 a través del paquete "plspm" (v 0.4.7).

Los cambios en las propiedades del compostaje se cuantificaron durante un experimento HTC a gran escala de 45 días de duración centrado en la temperatura, la descomposición de la materia orgánica y el contenido de carbono y nitrógeno. La temperatura aumentó rápidamente a alrededor de 90 °C después de 2 días de fermentación y permaneció >80 °C durante 9 días (“fase hipertermofílica”), después de disminuir gradualmente a 55 °C (“fase termófila”) y la temperatura ambiente para el día 27 ( “fase de maduración”, Fig. 1a). La descomposición de la materia orgánica (MO), el recambio de carbono y nitrógeno siguieron fases muy diferentes de HTC (Fig. 1a). En comparación con las materias primas de compostaje iniciales, los contenidos totales de carbono (TC, F3,23 = 33,6, p < 0,0001) y nitrógeno (TN, F3,23 = 19,8, p < 0,0001) disminuyeron significativamente en un 32% y un 28% al final. de HTC, respectivamente (Fig. S1a). De manera similar, el contenido de MO que mostró la mayor tasa de degradación en la fase hipertermófila disminuyó de 51,3% a 38,7% (F3,23 = 68,3, p < 0,0001), mientras que la concentración de carbono soluble en agua (WSC, F3,23 = 19,8 , p <0,0001) y el nitrógeno soluble en agua (WSN, F3,23 = 26,4, p <0,0001) aumentaron durante el HCT, alcanzando concentraciones máximas en la fase hipertermofílica (Fig. 1a). La tasa de degradación de OM se correlacionó positivamente con la temperatura, WSC y WSN (Fig. S1b), lo que indica un ciclo eficiente de nutrientes durante el HTC.

a Cambios en las propiedades del compostaje durante las diferentes fases de HTC. S0: fase inicial (D0); S1: fase hipertermofílica (D4 a D9); S2: fase termófila (D15 a D21); S3: fase de maduración (D27 a D45). Temp: temperatura de compostaje; OMDR: tasa de degradación de la materia orgánica; WSC: carbono soluble en agua; WSN: nitrógeno soluble en agua. b Cambios en la composición de la comunidad bacteriana (panel superior) y viral (panel inferior) durante diferentes fases de HTC según los puntos temporales de muestreo D0, D4, D15 y D27. c Cambios en la riqueza de especies bacterianas (panel superior) y virales (panel inferior) durante el HTC. d Cambios en la abundancia relativa de bacterias (panel superior; nivel de filos) y de taxones virales previstos durante el HTC (panel inferior; basado en el mapeo de lectura del metagenoma; n = 12). En (a) y (c), los datos muestran la media ± DE con tres réplicas biológicas por tratamiento (n = 3); minúsculas diferentes entre tratamientos denotan diferencias significativas en p < 0,05. Todos los conjuntos de datos se basan en la metagenómica.

Para vincular los cambios en la renovación de nutrientes con la dinámica de la comunidad microbiana, caracterizamos la diversidad y composición de la comunidad bacteriana y viral durante el HTC utilizando secuenciación metagenómica y de amplicones. De todas las lecturas metagenómicas, las secuencias bacterianas representaron entre el 50 y el 60%, mientras que menos del 1% pudieron asignarse a arqueas y eucariotas (hongos, protozoos y algas) y menos del 0,1% a virus. Según la secuenciación del gen 16S rRNA, durante el HTC se detectaron más de 11 filos bacterianos (Acidobacteriota, Actinobacteriota, Armatimonadota, Bacteroidota, Chloroflexota, Deinococcota, Gemmatimonadota, Firmicutes, Nitrospirota, Planctomycetota y Proteobacteria), con Firmicutes, Acidobacteriota, Bacteroidota, Deinococcota. , y Proteobacteria es el filo más dominante al representar el 92,5% de todos los taxones (Fig. S2a). Si bien estos filos estuvieron presentes constantemente en todas las etapas de HTC, mostraron cambios sustanciales en su abundancia (Fig. S2a). Las comunidades bacterianas se analizaron más a fondo en función del conjunto de datos metagenómicos. La temperatura del compostaje tuvo efectos significativos sobre la riqueza bacteriana (F3,8 = 44,1, p <0,001) y la composición (R2 = 0,89, p <0,001, prueba PERMANOVA, Fig. 1b, c). Proteobacteria (51,4%) y Bacteroidota (12,0%) fueron los filos más dominantes en la fase inicial del compostaje, mientras que los géneros termófilos Thermus y Planifilum pertenecientes a Firmicutes y Deinococcota aumentaron significativamente en abundancias relativas del 5,3% en D0 al 91,4% en D15 ( F3,8 = 25,8, p <0,001, figura 1d). La fase de maduración (D27) de HTC se asoció con altas abundancias relativas de Actinobacteriota, incluidos los géneros Actinomadura y Streptomyces (F3,8 = 72,6, p <0,0001). Tanto la abundancia de taxones bacterianos (según el nivel de filo) como la riqueza de la comunidad siguieron claramente las diferentes fases del compostaje de HTC (Fig. 1b, c; cambios cualitativamente similares observados según la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA, Fig. S2). El ensamblaje de la comunidad bacteriana (basado en el índice βNTI de la secuenciación de amplicones) se correlacionó con el ciclo del carbono y el nitrógeno y la temperatura de compostaje (todos p <0,0001, Fig. S3), indicativo de un ensamblaje de la comunidad de compost determinista y dependiente de la temperatura.

Primero nos centramos en analizar los cambios en las comunidades virales del ADN durante el compostaje. Se obtuvieron un total de 1507 supuestos cóntiges virales (con tamaños >5 kb) de los ensamblajes metagenómicos. Después de la agrupación (95 % de similitud de nucleótidos y más del 85 % de cobertura), se retuvieron un total de 1297 unidades taxonómicas operativas virales (vOTU) (Tabla S1), que pertenecían principalmente a virus de ADN de doble cadena (97 %) y se predijo que serían mayoritariamente lítico (66,2%). La calidad del genoma de las vOTU consistió en un 0,7% de vOTU de alta calidad, un 2,4% de calidad media y un 85,6% de vOTU de baja calidad, mientras que no se pudo determinar la calidad del 11,3% restante de vOTU. En general, el 78,6 % de las vOTU se detectaron durante las fases no termófilas (D0 y D27), mientras que el 21,3 % ocurrieron durante las fases termófilas (D4 y D15, Tabla S1). Solo el 7,7 % de las vOTU se pudieron agrupar con virus taxonómicamente conocidos en la base de datos RefSeq (v216, publicada en febrero de 2023), mientras que solo 35 vOTU (2,6 %) se agruparon con virus conocidos en la base de datos IMG/VR (v3), lo que sugiere que la mayoría de las Los virus del compostaje eran nuevos. Principalmente pertenecían a los filos Dividoviricota (88%) y Uroviricota (2%), y Mesyanzhinovviridae (27,2%), Herelleviridae (18,2%), Salasmaviridae (16,4%), Autographiviridae (5,4%), Vilmaviridae (5,4%) y Matshushitaviridae ( 3,6%) familias (Tabla S1 y Fig. S4). Al igual que con las bacterias, la riqueza (F3.8 = 4.7, p = 0.0359) y la composición (R2 = 0.78, p <0.001, prueba PERMANOVA) de las comunidades virales siguieron diferentes fases de HTC (Fig. 1d). Mientras que Vilmaviridae (37,8%) y Autographiviridae (14,5%) fueron virus dominantes en la materia prima de compostaje (D0), la abundancia de Vilmaviridae disminuyó significativamente a 1,5% en la fase de maduración (D27; F3,8 = 9,7, p = 0,0047, Fig. S4). Por el contrario, la abundancia relativa de la familia Matshushitaviridae bajo el filo Dividoviricota (que consiste principalmente en fagos Thermus asociados a termófilos) aumentó del 1,4% en D0 al 66,3% en D15 (F3,8 = 5,7, p = 0,0245, Fig. S4). Como la mayoría de los virus no se pudieron clasificar, también se investigaron las abundancias virales en función de la taxonomía de su huésped prevista (ver Métodos). La abundancia de taxones virales siguió a la abundancia de taxones bacterianos (Fig. 1d) y, por ejemplo, la abundancia de virus que infectan a Deinococcota aumentó claramente con el aumento de la temperatura de compostaje en el día 15. Además, las abundancias virales de Matshushitaviridae se correlacionaron positivamente con sus abundancias de huéspedes Firmicute (R2 = 0,34, p = 0,028) y Deinococcota (R2 = 0,53, p = 0,0042, Fig. S5). En general, los cambios en la riqueza de la comunidad viral (R2 = 0,50, p = 0,0058) y la composición (disimilaridad beta, R2 = 0,71, p <0,0001) se correlacionaron positivamente con los cambios en la riqueza y composición de la comunidad bacteriana (Fig. 2a, b).

La relación entre comunidades virales y bacterianas según los índices de riqueza (a) y de diversidad beta (b). c Árbol filogenético de MAG (nivel de filo) recuperado de metagenomas basado en un conjunto concatenado de 120 genes marcadores bacterianos de copia única conservados. Los círculos naranjas indican los linajes MAG que se predijo que estaban infectados por virus, y los números de vOTU identificados se muestran dentro de los círculos. La escala de árbol muestra las sustituciones de nucleótidos por sitio. d Correlación positiva entre la abundancia viral y bacteriana del huésped prevista en todas las muestras de compostaje. e Correlación negativa entre el número detectado de virus activos y bacterias huésped activas en todas las muestras de compostaje. (f) Vínculos virus-huésped previstos entre la taxonomía viral (a nivel familiar) y los MAG bacterianos durante el HTC. Los dos paneles de la izquierda representan la taxonomía del huésped coloreada por filo y género, y los dos paneles de la derecha muestran grupos virales asociados con los días de muestreo. Las líneas de conexión grises muestran asociaciones entre el huésped bacteriano (a nivel de filo y familia) y los virus asociados con puntos de tiempo de muestreo determinados a la derecha. En (a–e), el área sombreada muestra un intervalo de confianza del 95% alrededor de la línea media ajustada.

Para estudiar la dinámica virus-huésped con más detalle, reconstruimos genomas ensamblados en metagenomas (MAG) procariotas para bacterias agrupando contiges metagenómicos de escopeta. En total, se pudieron ensamblar 515 MAG de calidad media a alta (con una integridad estimada de ≥50 % y una contaminación ≤10 %) en todas las muestras, que incluían 513 bacterias y 2 arqueas. La desreplicación dentro de cada punto de tiempo redujo el número total de MAG bacterianos a 227 (17 filos, Fig. 2c), incluidos 180 MAG mesófilos (OGT <50 °C) y 47 termófilos (OGT ≥ 50 °C) según sus predicciones. temperaturas óptimas de crecimiento (OGT, Tabla S2). La composición taxonómica y la abundancia de MAG a nivel de filo fueron similares a los resultados basados ​​en los datos de secuenciación del gen 16 S rRNA (Fig. S6), lo que sugiere que los MAG eran representativos de la diversidad bacteriana total. Para asociar MAG bacterianos con virus, se utilizaron tres enfoques in silico diferentes: coincidencia de similitud de secuencia, enlaces espaciadores CRISPR y coincidencia de ARNt entre MAG y vOTU (ver Métodos). Encontramos que el 21,3% de las vOTU de compost estaban asociadas con supuestos huéspedes MAG según los tres métodos anteriores (Tabla S3). De estos virus, solo el 6,8% de las vOTU se asignaron taxonómicamente a las familias Mesyanzhinovviridae (24,0%) y Herelleviridae (22,0,6%). Los huéspedes comúnmente predichos incluyeron Actinobacteriota (18,4% de los pares virus-hospedador), Firmicutes (18,05%), Bacteroidota (17,3%), Patescibacteria (13,3%), Chloroflexota (11,2%), Proteobacteria (7,2%) y Deinococcota (2,5%). , que también fueron las bacterias más abundantes durante HTC (Fig. 2c-f). Los huéspedes virales también incluyeron bacterias termófilas con OGT prevista superior a 50 °C: Thermus thermophilus (T_bin.227, OGT = 69,8 °C), Planifilum fulgidum (T_bin.201, OGT = 58,9 °C) y Limnochordales (D15-1- bin.18, OGT = 70,1 °C). Los virus con huéspedes previstos representaron entre el 15% y el 33% de la comunidad viral total, y el 45% de los huéspedes putativos se asociaron con más de un virus, lo que indica polivalencia (Tabla S3). La abundancia de virus y bacterias (regresión lineal, R2 = 0,74, p <0,001) y la composición de la comunidad (estadística de Mantel r: 0,71, p <0,001) se correlacionaron positivamente entre sí (Fig. 2d), mientras que el número de MAG activos y vOTU se correlacionaron negativamente entre sí (Fig. 2e). En conjunto, estos resultados sugieren que la dinámica de la comunidad bacteriana y viral estuvo estrechamente acoplada durante el HTC.

Para vincular los cambios en la dinámica bacteria-virus con el funcionamiento total de la comunidad microbiana durante el HTC, anotamos todos los genes que pudimos detectar utilizando el enfoque unigenes (2,485,700 genes) [86] y los asignamos a diferentes categorías funcionales basadas en la base de datos de KEGG Orthology. Se pudo anotar un total del 38,2% de todos los genes (950.304), cuyas abundancias siguieron diferentes fases de HTC. Especialmente, los genes vinculados al metabolismo microbiano (metabolismo de carbohidratos, metabolismo de lípidos, metabolismo de aminoácidos y metabolismo de cofactores y vitaminas) se enriquecieron significativamente (p <0,05) en un 17% en las fases termófilas de HTC (Fig. S7a). Por el contrario, la abundancia relativa de genes asociados con el metabolismo del nitrógeno, la detección de quórum y los sistemas reguladores de dos componentes se redujo significativamente en un 19% (p <0,05) durante la fase termófila de HTC (D15, Fig. S7b).

Para explorar qué bacterias y virus estuvieron activos durante HTC, mapeamos lecturas metatranscriptómicas contra contigs metagenómicos, incluidos MAG y vOTU ensamblados. Aproximadamente, el 74% de las lecturas de ARNm filtradas de calidad podrían asignarse a ensamblajes metagenómicos. La actividad transcripcional de los MAG bacterianos siguió fases muy diferentes de HTC (Fig. 3a). Específicamente, las bacterias mesófilas fueron relativamente más activas en la fase inicial, incluidas las MAG pertenecientes a Armatimonadota (34,2%) y Actinobacteriota (22,5%), mientras que las bacterias termófilas se volvieron activas durante la fase hipertermófila (D15), incluidas Deinococcota (74,0%) y Firmicutes. (22,8%) (Fig. 3a y Fig. S8). Los cambios en la actividad de la comunidad bacteriana (basados ​​en la matriz de abundancia de ARN de MAG) se correlacionaron positivamente con varias propiedades del compostaje (Fig. S9). Por ejemplo, la actividad de las bacterias mesófilas estuvo altamente correlacionada con el ciclo del carbono (carbono total y contenido de carbono inorgánico) y la degradación de la MO (r de Mantel = 0,25–0,80, p <0,05), mientras que la actividad de las termófilas se asoció con la temperatura del compostaje y el nitrógeno. ciclismo (r de Mantel = 0,25–0,60, p <0,05).

a Gráficos de caja y mapa de calor que representan cambios en la actividad transcripcional de bacterias mesófilas (OGT <50 °C) y termófilas (OGT > 50 °C) (panel superior) y 180 MAG mesófilas y 47 termófilas (panel inferior) durante HTC. b Diagramas de caja y mapa de calor que representan cambios en la actividad transcripcional de virus asociados con bacterias mesófilas y termófilas (panel superior) y vOTU individuales (panel inferior) durante HTC. Diagramas de caja y mapas de calor que representan cambios en la actividad transcripcional de bacterias mesófilas (OGT < 50 °C) y termófilas (OGT > 50 °C) durante HTC en función de los MAG medios (panel superior) e individuales (panel inferior) (incluidos 180 mesófilos y 47 MAG termófilos) en asociación con genes del metabolismo del carbono (CAZyme) (c) y del nitrógeno (d). e Diagrama de caja y mapa de calor que representan cambios en la actividad transcripcional de genes del metabolismo del carbono asociado a virus (CAZyme) vinculados con MAG mesófilos (OGT <50 °C). En total (a – e), la actividad transcripcional media (MAG y vOTU) que se muestra en los diagramas de caja se basa en la abundancia de transcripciones (transcripciones por millón, TPM) normalizadas por las abundancias de MAG y vOTU. Los diagramas de caja abarcan los percentiles 25 a 75, los bigotes muestran los valores mínimo y máximo, y la línea media muestra la mediana (los puntos presentan las muestras biológicamente independientes, los asteriscos indican diferencias significativas (*p < 0,05, **p < 0,01. ns, no diferencias significativas). Los mapas de calor muestran la actividad transcripcional (MAG o vOTU) en función de la abundancia de transcripciones no normalizadas (transcripciones por millón, TPM). En (c y d), las CAZymes seleccionadas incluyen GH, GT, PL, CE, CBM y AA. Las vías metabólicas del nitrógeno incluyen la reducción de nitrato por asimilación, la reducción de nitrato por asimilación, la nitrificación y las vías de fijación de nitrógeno. Se pueden encontrar más detalles sobre los genes funcionales incluidos en los Datos complementarios 6 y 7, respectivamente.

En el caso de los virus, el 98,5% de las vOTU estuvieron activas siguiendo de cerca la temperatura de compostaje durante el HTC (Fig. 3b y Tabla S4). De las vOTU asignadas taxonómicamente, Autographiviridae (45,5%) y Vilmaviridae (20,6%) fueron los virus más activos al comienzo del compostaje (D0, Fig. S10). Mientras que la actividad de Autographiviridae se redujo al 1,3%, la actividad de Matshushitaviridae aumentó significativamente al 90,2% durante la fase hipertermofílica (Fig. S10). En general, los virus mesófilos fueron relativamente más activos al comienzo del compostaje y, especialmente, el virus desconocido NODE_4560_length_5650_cov_2.431093 tuvo una alta actividad transcripcional (3,5%) (Fig. 3b, Tabla S4). Por el contrario, los virus termófilos fueron más activos durante las fases hipertermófila (D15) y de maduración (D27), y el virus no clasificado NODE_636_length_12113_cov_2.763359 mostró una alta actividad transcripcional durante la fase hipertermófila (Fig. 3b, Tabla S4). Se observaron patrones de actividad similares con virus que solo podían clasificarse en función de sus taxones hospedadores previstos (Fig. S10). La actividad de los virus mesófilos solo se correlacionó con el ciclo del carbono (TC e IC) y la degradación de la OM (r de Mantel = 0,5–0,8, p <0,05, Fig. S9), mientras que la actividad de los virus termófilos se asoció significativamente con la temperatura de compostaje y el carbono. y ciclo del nitrógeno (r de Mantel = 0,25–0,50, p <0,05, Fig. S9). En conjunto, estos resultados muestran que tanto la actividad bacteriana como la viral se asociaron con el ciclo de nutrientes durante el HTC.

Para comprender los efectos de los virus y las bacterias en el ciclo de nutrientes a nivel funcional, exploramos la dinámica de expresión de genes catabólicos transportados tanto por bacterias como por virus. Todos los MAG bacterianos (227) codificaron genes del metabolismo esencial (Tabla S5). Específicamente, las enzimas activas en carbohidratos (CAZymes; 117 y 89 genes por MAG en promedio para mesófilos y termófilos, respectivamente), incluidas glucósidos hidrolasas (GH), glicosil transferasas (GT), polisacárido liasas (PL), esterasas de carbohidratos (CE), módulos de unión a carbohidratos (CBM) y actividades auxiliares (AA), indicativos de su importancia en la descomposición de polisacáridos. Además, se detectaron genes de proteinasa en todos los MAG (en promedio, 52,1 y 46,3 genes por cada MAG mesófilo y termófilo, respectivamente), mientras que el 70,6% de los MAG (2,6 y 0,89 genes por cada MAG mesófilo y termófilo, respectivamente) albergaban genes relacionados con la desnitrificación. (53,7%), reducción disimilatoria de nitratos (44,4%) y fijación de nitrógeno (3,5%). La expresión de la mayoría de estos genes siguió diferentes fases de HTC (Fig. 3c-e). Específicamente, los termófilos expresaron genes del metabolismo de los carbohidratos (CAZymes, F3.8 = 37.7, p <0.0001) durante las fases termófilas de HTC (D4 y D15, Fig. 3c), mientras que los genes del metabolismo del nitrógeno (F3.8 = 26.1, p = 0,00017) fueron expresados ​​por bacterias mesófilas en la fase inicial del compostaje (Fig. 3d). La actividad transcripcional de CAZymes y genes metabólicos de nitrógeno por MAG termófilos y mesófilos se asoció positivamente con el recambio de nutrientes durante el HTC (prueba de Mantel, p <0,05, respectivamente).

También comparamos la abundancia y actividad de genes metabólicos auxiliares (AMG) codificados por virus para el ciclo de nutrientes. Alrededor del 4% de los ORF virales anotados estaban relacionados con el transporte y el metabolismo de los carbohidratos y el transporte y el metabolismo de los aminoácidos (Fig. S11). La identificación de AMG virales se examinó más a fondo utilizando DRAM-v y curación manual. Se encontraron un total de 90 AMG putativos en 75 fagos mesófilos (unidos a huéspedes mesófilos), que representan las categorías KEGG del metabolismo de los carbohidratos, el metabolismo de los aminoácidos y el metabolismo del fósforo (Tabla S6). Un total de 34 AMG putativos pertenecían a 10 familias CAZyme involucradas en la descomposición de compuestos polisacáridos, como la hemicelulosa y la quitina (Fig. 3e y Tabla S6). Además, 14 AMG se asociaron con el metabolismo de la peptidasa y los aminoácidos y estos AMG estaban presentes en 14 contigs virales. Además, se detectaron dos AMG putativos implicados en el metabolismo del fósforo (p. ej., proteína PhoH inducible por falta de fosfato, fosfatasa alcalina D phoD) en 10 contigs virales (Tabla S6). En apoyo de análisis anteriores, no se encontraron AMG asociados con el metabolismo del nitrógeno inorgánico en ninguno de los contigs virales. Casi todos los AMG identificados se expresaron durante el compostaje (99,5%), lo que indica su importancia en la degradación de carbohidratos y exopolisacáridos (Fig. S12). Si bien el nivel de expresión de AMG totales disminuyó significativamente durante la fase termófila (Fig. S13a, F3,8 = 7.7, p = 0.009), la actividad de CAZyme disminuyó significativamente (Fig. 3e, F3,8 = 9.4, p = 0.0053) . Como resultado, la actividad de CAZyme viral se correlacionó positivamente con el ciclo del carbono durante HTC (R2 = 0,55, p <0,0001), mientras que no se observó una relación significativa con el ciclo del nitrógeno (R2 = 0,14, p = 0,15, Fig. S13b). En conjunto, estos resultados sugieren que los AMG codificados por virus mesófilos contribuyeron a la degradación de los carbohidratos complejos durante la fase no termófila del compostaje.

Investigamos si los virus podrían haber afectado la actividad catabólica bacteriana a través de la regulación de densidad de arriba hacia abajo de sus huéspedes en función de las proporciones virus-hospedador específicas del linaje (VHR; estimadas utilizando datos MAG y vOTU). En general, las abundancias virales superaron claramente a las abundancias bacterianas, y la VHR media de todos los linajes virus-huésped mostró un claro aumento en las fases termófilas (que van de 73,6 a 190,1; F3,8 = 9,0, p = 0,006, Fig. S14a). Los VHR más altos se observaron con Deinococcota en D15, seguido de Firmicutes en D27, y la dinámica de los VHR siguió a los cambios en la temperatura de compostaje (Fig. 4a). Se eligieron los doce MAG mesófilos y termófilos más dominantes (seis cada uno), cuyas abundancias representaron entre el 9,1% y el 69,7% de todos los MAG durante HTC, para estudiar la regulación de arriba hacia abajo de las densidades bacterianas por parte de sus virus (Fig. 4b). Las abundancias relativas de bacterias y virus estuvieron estrechamente relacionadas (R2 = 0,79 y R2 = 0,87, p <0,001) durante el HTC (Fig. 4c), mientras que tanto la actividad (R2 = 0,93 y R2 = 0,96, p <0,001) como las abundancias ( R2 = 0,79 y R2 = 0,87, p <0,001) de MAG termófilos y mesófilos se correlacionaron positivamente con sus abundancias y actividades virales (Fig. 4e). Sin embargo, la abundancia relativa y la actividad de bacterias y virus mesófilos y termófilos se correlacionaron negativamente entre sí, mostrando una clara sucesión microbiana durante el HTC (Fig. 4d-f). Como resultado, el VHR medio de los MAG termófilos aumentó con la temperatura de compostaje (específicamente para Thermus thermophilus, T_bin.227, D15; F3,8 = 5,7, p = 0,022), mientras que los VHR de los MAG mesófilos fueron claramente los más altos durante los períodos no -fases termofílicas (D0 y D27; F3,8 = 5.5, p = 0.023, Fig. S14b). Además, los cambios en los VHR se correlacionaron positivamente con la temperatura de compostaje (R2 = 0,63, p = 0,0012), WSC (R2 = 0,31, p = 0,034), WSN (R2 = 0,41, p = 0,015) y la tasa de degradación de OM (R2 = 0,56, p = 0,0056, Fig. 4g), lo que sugiere que los virus impulsaron el ciclo de nutrientes mediante la regulación de arriba hacia abajo de la densidad de las bacterias huésped durante el HTC.

un mapa de calor que muestra los cambios en las proporciones medias de abundancia de virus-huésped (VHR) basadas en todos los MAG y vOTU agrupados por taxonomía bacteriana del huésped prevista en cuatro puntos de tiempo de muestreo (D0, D4, D15, D27) durante HTC. b Cambios en la abundancia relativa de MAG mesófilos dominantes (panel izquierdo) y termófilos (panel derecho) (panel superior) y sus virus asociados (paneles inferiores; vOTU) durante el HTC. Los MAG y vOTU vinculados se muestran con los mismos colores. c Relaciones positivas entre MAG mesófilos y termófilos dominantes y sus virus basados ​​en abundancias relativas. d Relaciones negativas entre las abundancias relativas de virus mesófilos y termófilos dominantes con MAG mesófilos y termófilos, respectivamente. e Relaciones positivas entre MAG mesófilos y termófilos dominantes y sus virus según datos metatranscriptómicos (actividad transcripcional basada en transcripciones no normalizadas por millón de lecturas (TPM)). f Relaciones negativas entre la actividad relativa de los virus mesófilos y termófilos dominantes con los MAG mesófilos y termófilos, respectivamente. g Correlaciones positivas significativas entre los VHR totales y los cambios en las propiedades del compostaje durante el HTC. El área sombreada muestra un intervalo de confianza del 95% alrededor de la línea media ajustada. En todos los paneles (excepto a y b), los datos muestran valores medios de tres réplicas biológicas por tratamiento (n = 3).

Se construyeron modelos de regresión múltiple para explicar los cambios en el ciclo de nutrientes (comparación de matrices de disimilitud basadas en todas las propiedades del compostaje en el tiempo) con la actividad relativa de la comunidad bacteriana y viral (cambios en las matrices de disimilitud en el tiempo basados ​​en metatranscriptomas). La actividad de las comunidades bacterianas y virales (basadas en MAG y vOTU) explicó el 45,3% de la variación total en la renovación de nutrientes. Los virus mostraron una contribución relativamente mayor en comparación con las bacterias (Fig. 5a), lo que fue especialmente claro con el ciclo del carbono, mientras que la actividad bacteriana se asoció más fuertemente con el ciclo del nitrógeno (Fig. S15). La actividad de MAG (R2 = 0,21, p <0,001) y vOTU (R2 = 0,52, p <0,001) se correlacionó positivamente con los cambios en el ciclo de nutrientes (Fig. 5b), lo que sugiere que el recambio de nutrientes y las actividades bacterianas y virales se acoplaron durante HTC . Para desentrañar aún más la importancia relativa de las bacterias y virus mesófilos y termófilos en el ciclo del carbono y el nitrógeno, se construyeron modelos de ruta de mínimos cuadrados parciales (PLS-PM). Encontramos que la composición de la comunidad bacteriana se asoció positivamente con la actividad bacteriana y viral (Fig. 5c), mientras que las bacterias termófilas tuvieron una asociación negativa con las bacterias mesófilas como lo predijo la sucesión de la comunidad microbiana observada durante el HTC. Además, tanto los virus mesófilos como los termófilos se asociaron positivamente con sus bacterias huésped, lo que indica un estrecho acoplamiento de la dinámica virus-bacteria durante el HTC (Fig. 5c). De acuerdo con análisis anteriores, las bacterias mesófilas y termófilas se asociaron positivamente con el ciclo del carbono y el nitrógeno, y los mesófilos mostraron efectos relativamente más fuertes con el nitrógeno y los termófilos efectos más fuertes con el carbono (Fig. 5c). Por el contrario, sólo los virus mesófilos se asociaron con el ciclo del carbono, mientras que los virus termófilos no tuvieron asociaciones significativas con el recambio de nutrientes. En conjunto, estos hallazgos demuestran que tanto los virus mesófilos como los termófilos impulsaron el ciclo de nutrientes al regular la biomasa y la actividad bacteriana durante el HTC.

a Aumentos porcentuales en el MSE (error cuadrático medio) al estimar la importancia de las comunidades virales (vOTU) y bacterianas (MAG) para explicar la variación en el ciclo de nutrientes durante el HTC (valores más altos de MSE% implican una mayor importancia de un predictor determinado). Se calculó una medida aleatoria de importancia del predictor de la media del bosque para cada árbol y se promedió sobre el bosque (5000 árboles). b Correlaciones no lineales significativas entre la actividad comunitaria bacteriana (línea negra) y viral (línea azul) con el recambio de nutrientes (basado en todos los parámetros biogeoquímicos) durante el HTC según conjuntos de datos metatranscriptómicos. c Modelo de ruta de mínimos cuadrados parciales (PLS-PM) que compara la importancia relativa de diferentes factores que explican el ciclo de nutrientes durante el HTC. PLS-PM describe las relaciones entre comunidades virales y bacterianas (beta-disimilaridad basada en MAG mesófilos y termófilos o vOTU), actividad catabólica viral y MAG. Las fortalezas de los coeficientes de ruta se muestran como el ancho de la flecha y los números al lado de ellos, mientras que los colores azul, rojo y gris indican efectos negativos, positivos y no significativos, respectivamente. Los coeficientes de ruta y los coeficientes de determinación (R2) se calcularon después de 999 bootstraps y los niveles de significancia se indican cuando p <0,05. En (b), la nube gris representa un intervalo de confianza del 95% alrededor de los valores predichos. d Ilustración esquemática que describe las relaciones entre las bacterias mesófilas y termófilas y sus virus en relación con el ciclo de nutrientes durante el HTC.

Como estudios recientes han sugerido que los virus de ARN también podrían ser actores importantes pero pasados ​​por alto que subyacen al funcionamiento del ecosistema [77,78,79,80], utilizamos el gen distintivo de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP) como gen objetivo para estudiar la Diversidad y composición de virus de ARN durante el compostaje. Aproximadamente, el 0,23% de las lecturas de ARNm filtradas de calidad se pudieron asignar a estos contigs virales de ARN (Fig. S16a), lo que sugiere que los virus de ARN tenían una frecuencia muy baja en el metatranscriptoma. De estos 86 virus de ARN potenciales, 26 podrían agruparse con virus taxonómicamente conocidos en la base de datos viral RefSeq (v216). Principalmente, pertenecían a cuatro filos: Kitrinoviricota (69,2%), Negarnaviricota (11,5%), Pisuviricota (11,5%) y Lenarviricota (7,6%) (Fig. S16b). Más del 50% de los virus pertenecían a la familia Virgaviridae, que se compone principalmente de virus de plantas, y solo dos virus pertenecían a la familia Fiersviridae, que se han asociado con bacterias (Fig. S16c) [87]. La mayoría de estos virus de ARN (83%) estuvieron presentes en las fases inicial y de maduración del compostaje, y solo se detectaron unos pocos fagos de ARN (17%) en muestras recolectadas durante la fase termófila (D4 y D15). Esto puede deberse a la sensibilidad de los virus de ARN al calor [88]. En apoyo de esto, una gran cantidad de virus de ARN (basados ​​en el mapeo de lecturas de secuenciación de ARN en contigs portadores de RdRP usando coverM (v0.61, https://github.com/wwood/CoverM) siguieron fases de compostaje muy diferentes (Fig. S16d, e), y la mayoría de los virus de ARN tienen una gran abundancia en las fases inicial y de maduración del compostaje, mientras que casi desaparecen durante la fase termófila. También analizamos la presencia de fagos de ADNds en el conjunto de datos metatranscriptómicos utilizando los mismos métodos que con la metagenómica (excepto la herramienta VIBRANT ). Se obtuvieron un total de 68 supuestos contigs de fagos de ADNds (con tamaños >5 kb) de los ensamblajes metatranscriptómicos. Después de la agrupación (95% de similitud de nucleótidos y más de 85% de cobertura), se retuvieron un total de 41 virus de ADNds. Al comparar los Los virus dsDNA derivados de datos transcriptómicos y metagenómicos, el 89% de los virus (61 de 68) podrían ensamblarse a partir de datos transcriptómicos y metagenómicos, lo que sugiere que muy pocos virus dsDNA existen exclusivamente en conjuntos de datos metatranscriptómicos. Como resultado, la abundancia de la comunidad viral de ARN (basada en la disimilitud beta de la matriz de abundancia) no se correlacionó con los cambios en las propiedades del compostaje (estadístico de Mantel r = 0,0173, p = 0,35), lo que sugiere que no contribuyeron al ciclo de nutrientes. durante el compostaje.

Aquí estudiamos el papel de los virus en el ciclo de nutrientes durante el compostaje hipertermofílico utilizando conjuntos de datos metagenómicos y metatranscriptómicos replicados y muestreados temporalmente. Descubrimos que la dinámica de las comunidades bacteriana y viral estaba estrechamente acoplada y seguía diferentes fases de HTC y degradación de la materia orgánica. Específicamente, mientras que los virus mesófilos participaron en el ciclo de nutrientes al codificar AMG vinculados con el ciclo del carbono, los virus termófilos desempeñaron solo un papel indirecto a través de la regulación de arriba hacia abajo de las densidades de bacterias termófilas. El recambio de nutrientes se correlacionó positivamente con la proporción virus-huésped, lo que sugiere que las abundancias virales relativas podrían usarse como un indicador del funcionamiento del ecosistema (Fig. 5d). Estos efectos fueron impulsados ​​por los virus de ADN, ya que los virus de ARN se asociaron principalmente con eucariotas y no se correlacionaron con el ciclo de nutrientes durante el compostaje. Nuestros resultados están en línea con estudios previos que vinculan los virus de ADN con el recambio de nutrientes en los ecosistemas terrestres [4, 10, 89], destacando el papel de la diversidad viral y la actividad en los ciclos biogeoquímicos terrestres.

Tanto las comunidades bacterianas como las virales siguieron fases de compostaje muy diferentes, con mesófilos y termófilos dominando las fases no termófilas y termófilas, respectivamente. Además, los virus mostraron una alta actividad incluso durante la fase hipertermofílica (>90 °C) y superaron consistentemente la abundancia de bacterias en términos de relación de abundancia de virus-huésped. Las bacterias mesófilas y termófilas y sus virus mostraron una clara sucesión de comunidades microbianas, donde la fase inicial del compostaje estuvo dominada por mesófilos, que posteriormente fueron reemplazados por termófilos y posteriormente por mesófilos hacia el final del HTC. Aunque se ha observado una sucesión composicional similar de comunidades bacterianas y fúngicas en experimentos de compostaje anteriores [19, 90], esta es la primera evidencia que demuestra que los virus también pueden impulsar la sucesión ecológica en comunidades microbianas durante el HTC. Estos hallazgos también son indicativos de la hipótesis de "matar al ganador", donde los virus atacan y regulan el grupo más abundante de bacterias huésped, reduciendo los efectos de dominancia y nivelando la competencia entre diferentes taxones bacterianos [4, 89]. Tal dinámica podría explicar el cambio comunitario observado entre las fases termófila y de maduración de HTC, donde los virus termófilos probablemente redujeron la abundancia de bacterias termófilas, dando lugar a bacterias mesófilas y sus fagos. Por ejemplo, los géneros bacterianos Thermus y Planifilum desempeñan un papel importante en la producción de calor durante HTC [17] y se identificaron varios fagos líticos que infectaron a Thermus thermophilus (T_bin.227) y Planifilum fulgidum (T_bin.201), incluidos cinco virus Thermus potencialmente novedosos que tenía tamaños de genoma de aproximadamente 5 kpb similares al fago hipertermofílico φOH3 aislado de las aguas termales de Obama [91]. Si bien se predijo que el 61% de los fagos detectados serían líticos, es posible que algunas de las correlaciones entre los taxones bacterianos y virales también fueran impulsadas por fagos o profagos lisogénicos porque se usaron muestras de ADN sin filtrar para la metagenómica. Como resultado, nuestro conjunto de datos probablemente subestima la diversidad de fagos, y el enriquecimiento de fagos [92] debería utilizarse en estudios futuros. Además, el trabajo futuro también debería considerar el papel potencial de los virus de ARN para HTC, que no exploramos en detalle ya que las bacterias asociadas al compost se asocian con mayor frecuencia con virus de ADN [19]. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que una pequeña porción de virus termófilos jugó un papel clave en la actividad microbiana durante la fase termófila de HTC, lo que indica que el funcionamiento del ecosistema de compost fue impulsado, al menos temporalmente, por comunidades microbianas de baja diversidad. Por lo tanto, los fagos terrestres podrían ser importantes impulsores del ciclo biogeoquímico en los ecosistemas del suelo a través de una "derivación viral" similar a los fagos marinos [11, 93].

Las actividades virales y bacterianas también se correlacionaron positivamente entre sí, y la proporción virus-huésped se correlacionó positivamente con los cambios en el ciclo del carbono y el nitrógeno. Si bien tanto las bacterias mesófilas como las termófilas expresaron activamente genes relacionados con el ciclo del carbono y el nitrógeno, solo los virus mesófilos codificaron AMG relacionados con el metabolismo del carbono, mientras que no se encontraron AMG relacionados con el metabolismo en los virus termófilos. Estos hallazgos están en línea con estudios previos realizados en ecosistemas marinos y terrestres, que han identificado una variedad de AMG relacionados con el metabolismo del nitrógeno [94], el metabolismo del carbono [95], el metabolismo del fosfato [96] y el ciclo del azufre [97] en Virus mesofílicos. Sin embargo, si bien las AMG virales ligadas al carbono se detectan con frecuencia en diversos entornos [4, 14, 27], las AMG virales asociadas con el ciclo del nitrógeno se han observado con menos frecuencia [94] y tampoco se encontraron en nuestro estudio. Todos los AMG virales asociados al carbono eran enzimas activas en carbohidratos (CAZymes) y su actividad transcripcional se correlacionó significativamente con el recambio de carbono durante el HTC. Una posible explicación para la prevalencia relativamente mayor de AMG virales asociados al carbono es que podrían proporcionar más beneficios para las bacterias huésped, ya que la matriz de compostaje contiene mucho carbono orgánico [16, 98]. No se codificaron CAZymes por virus termófilos. Una razón para esto podría ser que los virus termófilos se han adaptado para codificar AMG no relacionados con el metabolismo para mejorar la supervivencia bacteriana y su propia supervivencia en entornos estresantes [3, 14]. En apoyo de esto, muchos AMG termófilos se asociaron con el metabolismo de aminoácidos y nucleótidos, y su actividad transcripcional aumentó significativamente durante la fase termófila. A pesar de los efectos dispares sobre el metabolismo, ambos tipos de virus desempeñaron un papel indirecto en el ciclo de los nutrientes al regular la abundancia de bacterias y la actividad catabólica mediante el control de densidad de arriba hacia abajo. Sin embargo, se requiere más trabajo para validar directamente el funcionamiento de las AMG virales descubiertas en el futuro. Además, como sólo una fracción muy pequeña de las vOTU eran de alta calidad, nuestro análisis probablemente subestimó la diversidad funcional y el contenido genético de los virus. Finalmente, utilizamos nuestro conjunto de datos de metatranscriptómica para explorar el papel potencial de los virus de ARN en el compostaje. La mayoría de los virus de ARN detectados (82%) estaban asociados con huéspedes eucariotas y tenían abundancias relativas bajas durante la fase hipertermófila del compostaje. Esto está en línea con estudios previos que sugieren que los virus de ARN tienen huéspedes principalmente eucariotas [77] y que el ciclo de nutrientes durante el compostaje es impulsado principalmente por organismos procarióticos [19, 21]. Por lo tanto, los virus de ARN probablemente desempeñaron un pequeño papel en el ciclo de nutrientes durante el HTC.

En conclusión, este estudio proporciona evidencia de la importancia de los virus en los ciclos bioquímicos terrestres y el recambio de nutrientes, especialmente en ambientes termófilos extremos. Gran parte de la diversidad viral descubierta estaba ausente en las bases de datos de secuencias de referencia, lo que destaca el descubrimiento continuo de una nueva diversidad viral y su papel en los ecosistemas microbianos. Una razón para esto podría ser que el entorno HTC es muy específico de taxones bacterianos y virales que no se encuentran en otros ecosistemas terrestres o acuáticos. Además de ejercer una fuerte regulación de arriba hacia abajo e impulsar la sucesión de comunidades microbianas entre bacterias mesófilas y termófilas, los AMG virales se asociaron con el ciclo del carbono durante las fases mesófilas del compostaje. Además, la abundancia viral a menudo superaba a la abundancia bacteriana y los picos elevados de proporción virus-huésped se asociaron con una degradación eficiente de la materia orgánica. Por lo tanto, la abundancia viral relativa podría utilizarse como indicador del ciclo eficiente de nutrientes y del funcionamiento del ecosistema microbiano para optimizar la productividad de los sistemas biotecnológicos y agrícolas.

Los datos de lecturas sin procesar generados a partir de la secuenciación de amplicones y escopetas en este estudio se han depositado en el NCBI SRA (PRJNA861164, PRJNA861429 y PRJNA861433) y están disponibles públicamente. Los números de acceso al archivo de lecturas cortas para lecturas individuales se enumeran en los datos complementarios 7. Todos los genomas virales y bacterianos ensamblados y los códigos R utilizados en este estudio están disponibles en Zenodo (https://zenodo.org/record/7397132#). Los autores declaran que los demás datos principales que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en este artículo y en los archivos de información complementaria.

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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Agricultura Moderna del Laboratorio de Lingnan (NT2021010), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (42277357), la Fundación Científica Juvenil Destacada de la provincia de Fujian (2022J06016) y los fondos conjuntos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China ( U21A20295). V-PF está financiado por la Royal Society (subvenciones nos. RSG\R1\180213 y CHL\R1\180031) y conjuntamente por una subvención de UKRI, Defra y el gobierno escocés, en el marco del Programa de Enfermedades Bacterianas de las Plantas del Fondo de Prioridades Estratégicas ( BB/T010606/1).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Helsinki, incluido el Hospital Central de la Universidad de Helsinki.

Laboratorio Provincial Clave de Regulación y Salud Ambiental del Suelo de la Provincia de Fujian, Facultad de Recursos y Medio Ambiente, Universidad Agrícola y Forestal de Fujian, Fuzhou, 350002, China

Hanpeng Liao, Chen Liu, Chaofan Ai, Tian Gao, Qiu-E Yang y Shungui Zhou

Laboratorio de Guangdong para la agricultura moderna de Lingnan, Guangzhou, 510642, China

Hanpeng Liao y Shungui Zhou

Instituto de Ciencias Ecoambientales y del Suelo, Academia de Ciencias de Guangdong, Guangzhou, 510650, China

zhenyu

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510275, China

shaoming gao

Departamento de Biología, Universidad de York, Wentworth Way, YO10 5DD, York, Reino Unido

Ville-Petri Friman

Departamento de Microbiología, Universidad de Helsinki, Helsinki, 00014, Finlandia

Ville-Petri Friman

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HP, CL, CF, YZ, SM y GT analizaron la mayoría de los datos de los experimentos de laboratorio y HP y CL realizaron y analizaron la mayoría de los datos de los experimentos de compostaje. HL y CL realizaron la mayoría de los análisis estadísticos. VPF y HP diseñaron los experimentos, contribuyeron con aportes intelectuales y ayudaron con los análisis de datos de secuenciación. HL y VPF escribieron el manuscrito con la ayuda de todos los coautores. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito. HP y SZ supervisaron el estudio.

Correspondencia a Shungui Zhou o Ville-Petri Friman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Liao, H., Liu, C., Ai, C. et al. Los virus mesófilos y termófilos están asociados con el ciclo de nutrientes durante el compostaje hipertermofílico. ISME J 17, 916–930 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01404-1

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Recibido: 05 de octubre de 2022

Revisado: 20 de marzo de 2023

Aceptado: 22 de marzo de 2023

Publicado: 08 de abril de 2023

Fecha de emisión: junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01404-1

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